Подход, основанный на использовании нанотел, позволяет эффективно флуоресцентно маркировать эндогенные белки.

от

Исследователи из Института биофизики Китайской академии наук разработали инновационный метод визуализации и быстрого скрининга малых пептидных вставок

Группа учёных под руководством профессора Сюй Пинъёна из Института биофизики Китайской академии наук разработала новый подход под названием ALFA Nanobody-guided Endogenous Labeling (ANGEL). Этот метод решает давнюю проблему высокопроизводительного скрининга нефлуоресцентных малых пептидных вставок. Результаты исследования были опубликованы в журнале Nature Chemical Biology 29 августа.

Нанотела благодаря своему малому размеру (~15 кДа), высокой стабильности и сильному сродству связывания стали мощными инструментами в молекулярной биологии. При слиянии с флуоресцентными белками для формирования хромободи они позволяют проводить многоцветную маркировку живых клеток, визуализацию с высоким разрешением и исследования динамики белков в реальном времени. Однако разработка традиционных хромободи трудоёмка и требует много времени.

Принцип работы метода ANGEL

Согласно исследователям, в основе ANGEL лежит метка ALFA — рационально сконструированный пептид из 13 аминокислот, образующий стабильную α-спираль. Метка ALFA меньше большинства традиционных линейных эпитопных меток и обладает отличной химической стабильностью.

Они обнаружили, что стабильность NbALFA, нанотела с высоким сродством к метке ALFA, зависит от присутствия метки. В отсутствие ALFA NbALFA частично деградирует. Однако повышение внутриклеточного уровня ALFA стабилизирует NbALFA и усиливает его флуоресцентный сигнал.

Для использования этого свойства исследователи создали стабильные клеточные линии, экспрессирующие NbALFA, слитый с флуоресцентным белком, и интегрировали его в геном для обеспечения равномерной экспрессии в отсутствие метки ALFA.

Используя CRISPR-опосредованное редактирование генов, они точно вставили метку ALFA в целевые локусы и отслеживали изменения флуоресценции NbALFA для эффективного выявления успешно отредактированных клеток.

Возможности метода ANGEL

Метод ANGEL продемонстрировал замечательную универсальность, успешно маркируя широкий спектр эндогенных белков, включая CKAP4, SEC61B, RTN4, виментин, нуклеопорины NUP96 и NUP35, гистон H2BC21, CBX1, Lamin A/C, актин и даже ядерный белок-компонент спеклов SON с молекулярной массой 264 кДа.

Благодаря флуоресцентной многоцветной маркировке на основе нанотел метод ANGEL позволяет проводить визуализацию на разной глубине тканей и совместим с различными методами микроскопии. Что особенно важно, ANGEL предоставляет надёжную платформу для изучения биологических функций эндогенных белков в нативных регуляторных условиях в реальном времени, преодолевая ограничения традиционных систем сверхэкспрессии.

Эта работа открывает новые возможности для исследований функций белков, динамической визуализации клеток и открытия лекарств, утверждая ANGEL в качестве платформы нового поколения для прецизионной маркировки белков и функционального анализа.

Предоставлено Китайской академией наук.

Источник

Другие новости по теме

Другие новости на сайте