Исследователи разработали высокоскоростной микроскоп для трёхмерной визуализации, который может одновременно фиксировать динамику клеток всего небольшого организма. Способность визуализировать трёхмерные изменения в режиме реального времени на большом поле зрения может привести к новым открытиям в области биологии развития и неврологии.
Традиционные микроскопы ограничены
Традиционные микроскопы ограничены скоростью, с которой они могут перефокусироваться или сканировать различные глубины. Это затрудняет съёмку быстрых биологических процессов без искажений или потери информации.
«Традиционные микроскопы ограничены скоростью перефокусировки или сканирования различных глубин, что затрудняет съёмку быстрых биологических процессов без искажений или потери информации», — сказал Эдуардо Хирата Миясаки, который выполнял работу в лаборатории Сары Абрахамссон в Калифорнийском университете в Санта-Крузе (UCSC), а сейчас работает в Chan Zuckerberg Biohub.
Новая система расширяет возможности мультифокусной микроскопии
Новая система расширяет возможности техники мультифокусной микроскопии (MFM), разработанной Абрахамссон. Для этого используется массив из 25 камер, что позволяет расширить возможности скорости и объёмной визуализации. Этот скачок в эффективности открывает двери для изучения малых живых систем в движении без их нарушения.
В журнале Optica исследователи описывают свой новый микроскоп, который сочетает дифракционную оптику с 25 миниатюрными камерами для синхронной и одновременной визуализации на нескольких глубинах. Они демонстрируют визуализацию в реальном времени 25-плоскостных трёхмерных объёмов размером до 180 x 180 x 50 микрон со скоростью захвата более 100 объёмов в секунду.
Новый микроскоп особенно полезен для визуализации плавающих червей C. elegans
Новый микроскоп, который мы называем M25, особенно полезен для визуализации плавающих червей C. elegans, модельного организма, используемого для изучения развития, неврологии и локомоции.
«Традиционно учёные могли одновременно чётко видеть только часть организма. С помощью нашего нового микроскопа можно наблюдать за всем червём, который движется естественным образом в трёх измерениях, что позволяет исследователям изучать, как его нервная система контролирует движение и как поведение может меняться в ответ на генетическую мутацию, заболевание или лечение препаратами», — сказал Хирата Миясаки.
Дифракционные оптические элементы
Ключевой частью нового микроскопа являются дифракционные оптические элементы, используемые для распределения различных фокальных плоскостей по массиву из 25 камер. Дифракционная оптика использует микроструктуры для управления светом, что позволяет более сложное управление светом с помощью более тонкого и лёгкого компонента, чем традиционные оптические компоненты, такие как призмы.
Исследователи разработали многофокусную решётку для разделения входящего света так, чтобы каждая камера захватывала одну и ту же сцену, но с фокусом на разной глубине. Они также изготовили индивидуальные решётки для использования перед каждой линзой камеры, чтобы исправить хроматическую дисперсию, вносимую многофокусной решёткой.
Заменив традиционную призму для хроматической коррекции, которую было трудно масштабировать за пределы массивов 3×3, эти блэз-решётки позволили добиться высококачественной высокоскоростной биовизуализации на большем количестве плоскостей.
Программное обеспечение для синхронизации данных
Исследователи также разработали новое программное обеспечение для решения задачи быстрой синхронизации и сбора данных с 25 различных камер одновременно и сохранения их в компьютере.
«Когда все 25 изображений объединяются — все они получены одновременно, без механического сканирования или движущихся частей — формируется полный трёхмерный снимок», — сказал Хирата Миясаки. «Поскольку это происходит на высокой скорости, ограниченной только скоростью захвата камеры и яркостью образца, мы можем записывать целые объёмы с течением времени, что позволяет изучать реальную биологическую динамику».
Совместимость с различными методами визуализации
Микроскоп M25 может использоваться как для флуоресцентной, так и для безаппаратной визуализации, такой как светлопольная и поляризационная микроскопия, которые особенно полезны для визуализации чувствительных биологических систем без введения красителей или меток. Эта совместимость с минимально инвазивными методами делает M25 хорошо подходящим для таких приложений, как эмбриология, где сохранение естественной физиологии имеет решающее значение.
Для проверки прибора исследователи создали прототип и подтвердили, что он может одновременно захватывать 25 различных равномерно расположенных фокальных плоскостей без искажений или наложения, визуализируя калибровочные мишени.
Они также использовали микроскоп для визуализации живых биологических образцов, включая распространённые модельные организмы, такие как C. elegans, D. melanogaster и P. marinus, продемонстрировав трёхмерную визуализацию движущихся организмов в реальном времени без необходимости сканирования или компенсации движения.
Система монтируется в боковой порт стандартного коммерческого микроскопа. Помимо дифракционной оптики, для работы не требуется специализированное оборудование, что упрощает её воспроизведение по сравнению с системами, основанными на специальных призмах или сложных модификациях светового пути.
Подробные этапы изготовления хроматических коррекционных блэз-решёток и мультифокусных решёток, используемых в системе трёхмерной визуализации M25, доступны на сайте [Zenodo](https://zenodo.org/records/15522415). Эти компоненты можно изготовить в любом академическом центре нанофабрикации, включая [UCSB Nanofabrication facility](https://nanofab.ucsb.edu/).
Механизм захвата и плагин napari доступны на [GitHub](https://github.com/SaraLab-Group/m25-napari).
Исследователи планируют расширить масштабы системы и области её применения. Например, они планируют использовать богатые данные визуализации системы для обучения моделей машинного обучения, которые могут определять состояния клеток, отслеживать динамическое поведение и обнаруживать изменения, связанные с заболеваниями, непосредственно на изображениях.