Исследователи разработали высокоскоростной микроскоп для трёхмерной визуализации, который может одновременно фиксировать детальные изменения динамики клеток всего небольшого организма.
Способность визуализировать трёхмерные изменения в режиме реального времени на большом поле зрения может привести к новым открытиям в биологии развития и неврологии.
Ограничения традиционных микроскопов
Традиционные микроскопы ограничены скоростью, с которой они могут перефокусироваться или сканировать различные глубины. Это затрудняет съёмку быстрых биологических процессов без искажений или потери информации.
Эдуардо Хирата Миясаки, который выполнял работу в лаборатории Сары Абрахамссон в Калифорнийском университете в Санта-Крузе (UCSC), а сейчас работает в Chan Zuckerberg Biohub, сказал: «Традиционные микроскопы ограничены скоростью перефокусировки или сканирования на разных глубинах, что затрудняет съёмку быстрых биологических процессов без искажений или потери информации».
Новая система
Новая система расширяет технику мультифокусной микроскопии (MFM), разработанную Абрахамссон, используя массив из 25 камер для повышения скорости и объёмной визуализации. Этот скачок в эффективности открывает возможности для изучения малых живых систем в движении без их нарушения.
В журнале Optica исследователи описывают свой новый микроскоп, который сочетает дифракционную оптику с 25 миниатюрными камерами для синхронной и одновременной визуализации на нескольких глубинах. Они демонстрируют визуализацию в реальном времени 25-плоскостных трёхмерных объёмов размером до 180 x 180 x 50 микрон со скоростью захвата более 100 объёмов в секунду.
Применение
Новый микроскоп, который исследователи называют M25, особенно полезен для визуализации плавающих червей C. elegans, модельного организма, используемого для изучения развития, неврологии и локомоции.
Традиционно учёные могли ясно видеть только часть организма в любой момент времени. С помощью нового микроскопа можно наблюдать за движением всего червя в трёхмерном пространстве, что позволяет исследователям изучать, как его нервная система контролирует движение и как поведение может меняться в ответ на генетические мутации, болезни или лекарственное лечение.
Дифракционная оптика
Ключевой частью нового микроскопа являются дифракционные оптические элементы, используемые для распределения различных фокальных плоскостей по массиву из 25 камер. Дифракционная оптика использует микроструктуры для управления светом, что позволяет более сложное управление светом с помощью более тонкого и лёгкого компонента, чем традиционные оптические компоненты, такие как призмы.
Исследователи разработали многофокусную решётку для разделения входящего света так, чтобы каждая камера захватывала одну и ту же сцену, но с фокусом на разной глубине. Они также изготовили индивидуальные решётки для использования перед каждой линзой камеры для коррекции хроматической дисперсии, вносимой многофокусной решёткой.
Заменив традиционную призму для хроматической коррекции, которую было трудно масштабировать за пределы массивов 3×3, эти блейз-решётки позволили осуществлять биовизуализацию высокого разрешения и высокой скорости по большему количеству плоскостей.
Нановолоконные элементы
Решётки изготовлены из наноразмерных структур, для создания которых требуются специализированные инструменты для изготовления. После использования моделирования для определения оптимальных конструкций исследователи использовали нанофабрику Калифорнийского университета в Санта-Барбаре для травления узоров на стекле. Теперь, когда процесс изготовления налажен, эти дифракционные элементы можно точно воспроизводить в больших объёмах.
Сара Абрахамссон сказала: «Одной из ключевых инноваций M25 является использование упрощённой архитектуры хроматической коррекции. Заменив громоздкие компоненты на основе призм на специально разработанные блейз-решётки, система обеспечивает эффективную коррекцию дисперсии на всех фокальных плоскостях, оставаясь при этом компактной и масштабируемой».
Исследователи также разработали новое программное обеспечение для решения задачи быстрой синхронизации и сбора данных с 25 различных камер одновременно и сохранения их в компьютере.
Хирата Миясаки сказал: «Когда 25 изображений объединяются — все они получены одновременно, без механического сканирования или движущихся частей — формируется полный трёхмерный снимок. Поскольку это происходит на высокой скорости, ограниченной только скоростью захвата камеры и яркостью образца, мы можем записывать целые объёмы с течением времени, что позволяет изучать реальную биологическую динамику».
Совместимость
Микроскоп M25 может использоваться как для флуоресцентной, так и для бестемповых методов, таких как светлопольная и поляризационная микроскопия, которые особенно полезны для визуализации чувствительных биологических систем без введения красителей или меток. Эта совместимость с минимально инвазивными методами делает M25 хорошо подходящим для таких приложений, как эмбриология, где сохранение нативной физиологии имеет решающее значение.
Для проверки прибора исследователи создали прототип и подтвердили, что он может одновременно захватывать 25 различных равномерно расположенных фокальных плоскостей без искажений или наложения, визуализируя калибровочные мишени.
Они также использовали микроскоп для визуализации живых биологических образцов, включая распространённые модельные организмы, такие как C. elegans, D. melanogaster и P. marinus, продемонстрировав трёхмерную визуализацию движущихся организмов в реальном времени без необходимости сканирования или компенсации движения.
Система монтируется в боковой порт стандартного коммерческого микроскопа. Помимо дифракционной оптики, для её работы не требуется специализированное оборудование, что упрощает её воспроизведение по сравнению с системами, основанными на специальных призмах или сложных модификациях световых путей.
Подробные этапы изготовления хроматических коррекционных блейз-решёток и мультифокусных решёток, используемых в системе трёхмерной визуализации M25, доступны на [сайте](https://zenodo.org/records/15522415). Эти компоненты можно изготовить в любом академическом центре нанофабрикации, включая [UCSB Nanofabrication facility](https://nanofab.ucsb.edu/).
Механизм захвата и плагин napari доступны на [GitHub](https://github.com/SaraLab-Group/m25-napari).
Исследователи планируют расширить масштабы и приложения системы. Например, они планируют использовать богатые данные визуализации системы для обучения моделей машинного обучения, которые могут определять состояния клеток, отслеживать динамическое поведение и обнаруживать изменения, связанные с заболеваниями, непосредственно на изображениях.