Структура митохондриального фермента на атомном уровне раскрывает механизм обработки РНК

Исследователи из отдела клеточной и молекулярной биологии Каролинского института впервые получили подробные молекулярные снимки действия человеческой полинуклеотидфосфорилазы (hPNPase), что позволило понять, как этот важный митохондриальный фермент расщепляет РНК с помощью изящного механизма переворачивания оснований.

Основные выводы

Результаты, [опубликованные](https://academic.oup.com/nar/article/doi/10.1093/nar/gkaf1296/8373964) в Nucleic Acids Research, предоставляют беспрецедентные детали на атомном уровне о каталитическом цикле фермента и объясняют, как мутации в этом белке приводят к тяжёлым наследственным заболеваниям.

Используя крио-электронную микроскопию одиночных частиц, исследовательская группа зафиксировала hPNPase в трёх различных функциональных состояниях, создав, по сути, молекулярный фильм деградации РНК с почти атомным разрешением.

Механизм действия фермента

«Мы были удивлены, обнаружив, что фермент использует механизм переворачивания оснований, по сути, поворачивая концевые нуклеотиды на 180 градусов, чтобы контролировать, где и когда он разрезает РНК», — говорит первый автор Оле Унсельд, доктор философии, исследователь в отделе клеточной и молекулярной биологии, КИ.

В начальном загрузочном состоянии РНК принимает U-образную конформацию, которая правильно распознаёт РНК и предотвращает преждевременное расщепление. Только после переворачивания концевых оснований фосфодиэфирная связь перемещается в положение для катализа.

Роль ионов магния

Структуры показывают, что ион магния играет двойную каталитическую роль: сначала позиционирует атакующую фосфатную молекулу, а затем стабилизирует переходное состояние реакции. Такой уровень детализации механизма ранее не был достигнут для какой-либо эукариотической полинуклеотидфосфорилазы.

Эксперименты по захвату различных стадий каталитического цикла

Для захвата различных стадий каталитического цикла исследователи использовали стратегические биохимические подходы. Для загрузочного состояния они использовали РНК-субстраты, содержащие фосфоротиоатные модификации, которые замедляют, но не прекращают расщепление. Для предкаталитического состояния они заменили фосфат на сульфат, который связывается в активном центре, но не поддерживает катализ.

«Этот проект потребовал тщательной стабилизации промежуточных состояний реакции, чтобы мы могли увидеть отдельные шаги, а не среднее значение», — отмечает второй автор Хришикеш Дас, научный специалист в том же отделе. «Интеграция крио-ЭМ с биохимией стала ключом к определению роли иона Mg²⁺ и Pi и описанию последовательности конформационных изменений во время связывания РНК и катализа».

Результаты экспериментов по масс-спектрометрии РНК

Эксперименты по масс-спектрометрии РНК дополнили биохимическую и структурную работу, показав, что hPNPase преимущественно высвобождает динуклеотидные продукты из 3′-конца РНК, причём тринуклеотиды представляют минимальную длину продукта. Этот паттерн процессивности отличается от бактериальных ферментов и отражает структурные ограничения активного сайта человеческого фермента.

Открытие нового механизма доступа РНК к активному центру фермента

Исследование опровергло давнее предположение о том, как РНК получает доступ к активному центру фермента. В отличие от бактериальных PNPase, у которых РНК проходит через центральную пору, пора человеческого фермента заблокирована гибкими белковыми петлями. Вместо этого структуры показывают, что одноцепочечная РНК входит в тримерную сборку снизу.

«Это было совершенно неожиданно», — объясняет главный научный сотрудник Мартин Хёллберг из отдела клеточной и молекулярной биологии, КИ, который руководил исследованием. «Гибкие петли, которые закрывают пору, не просто блокируют вход РНК, они активно регулируют активность фермента, стабилизируя активный центр при связывании РНК. Это представляет собой эукариотическую адаптацию, не характерную для более простых организмов».

Практическое значение исследования

Детальное сравнение с бактериальными полинуклеотидфосфорилазами выявило ключевые структурные адаптации человеческого фермента. Активный сайт содержит вставку аминокислот, отсутствующую у прокариот, а альфа-спиральный домен перемещён ближе к РНК-субстрату. Эти изменения создают изогнутую конформацию РНК, стабилизируемую дополнительными контактами белок-РНК.

Эти структурные различия объясняют несколько уникальных свойств человеческой PNPase: её способность эффективно обрабатывать окислительно повреждённую РНК, содержащую 8-оксогуанин, производство олигонуклеотидных, а не мононуклеотидных продуктов, и сниженную активность полиаденилирования по сравнению с бактериальными версиями. Адаптации, вероятно, отражают окислительную среду митохондрий и специализированные требования контроля качества эукариотических клеток.

Влияние на понимание заболеваний

Хотя это исследование было сосредоточено на фундаментальных механизмах действия ферментов, полученные результаты имеют прямое отношение к пониманию заболеваний человека. Мутации в гене PNPT1, который кодирует hPNPase, вызывают синдром Ли (тяжёлое прогрессирующее неврологическое расстройство), наследственную потерю слуха и недостаточность дыхательной цепи. Эти состояния возникают из-за того, что hPNPase необходима для поддержания контроля качества митохондриальной РНК. Когда фермент работает неправильно, накапливаются аномальные молекулы РНК, нарушая выработку энергии в клетках.

Исследование предоставляет молекулярную основу для генетического консультирования. Мутации, влияющие на остатки активного центра, идентифицированные в этом исследовании, такие как аспартаты, координирующие магний, или аргинины, связывающие РНК, с большой вероятностью будут патогенными. И наоборот, мутации в поверхностных областях, удалённых от функциональных сайтов, могут быть доброкачественными вариантами. Эта карта структуры и функции улучшает интерпретацию результатов генетических тестов для пострадавших семей.

«Понимание того, как именно этот фермент работает на атомном уровне, даёт нам решающее понимание того, почему мутации вызывают заболевание», — говорит Хёллберг. «Структуры показывают, какие именно аминокислоты имеют решающее значение для связывания РНК, катализа и регуляции. Когда врачи выявляют новые мутации PNPT1 у пациентов, они теперь могут сопоставить эти изменения с нашими структурными моделями, чтобы предсказать, нарушат ли они функцию фермента».

Исследование открывает несколько новых направлений исследований. Команда сейчас изучает, как hPNPase взаимодействует с митохондриальной хеликазой hSuv3, образуя более крупный комплекс деградации РНК, называемый деградосомой. Гибкие регуляторные петли, идентифицированные в этом исследовании, могут обеспечивать сайты связывания для белков-партнёров, что предполагает сложную регуляторную сеть.

Хотя терапевтические применения остаются отдалёнными, структурные данные обеспечивают основу для будущих усилий по открытию лекарств. Архитектура активного сайта и идентификация ключевых каталитических остатков могут в конечном итоге позволить разработать небольшие молекулы, модулирующие активность фермента. Однако такие применения появятся через несколько лет и потребуют обширных дополнительных исследований.

Предоставлено
[Karolinska Institutet](https://phys.org/partners/karolinska-institutet/)

Источник