В 1976 году рабочие, прокладывавшие туннель для торонтского метро, обнаружили очень старые кости. С помощью радиоуглеродного анализа исследователи определили, что частичному черепу и фрагментам рогов примерно 12 000 лет.
Для современных биологов необычным было то, что эти окаменелости — единственный известный экземпляр Torontoceros hypogaeus, ныне вымершего копытного. До недавнего времени было загадкой, какое место Torontoceros занимает в эволюционной истории. Но в октябре исследователи выяснили, что это копытное — родственник белохвостого оленя. Это открытие стало возможным благодаря секвенированию ДНК.
Извлечение ДНК из костей тысячелетней давности
Чтобы извлечь ДНК из древних образцов, учёным требуется стерильная лаборатория, дрель и немного удачи.
ДНК есть повсюду, и это может быть проблемой. Каждый наш чих и кашель оставляют в воздухе и на земле кусочки нас самих, но вокруг нас также есть невидимые бактерии и вирусы, у которых тоже есть своя ДНК.
Как объяснил Аарон Шафер, доцент Университета Трента, который руководил исследованием по секвенированию Torontoceros, вся эта плавающая вокруг ДНК требует создания лаборатории, которую можно облучать ультрафиолетом, чтобы уничтожить любые возможные загрязнители.
Исследователи в стерильных комбинезонах и масках N95 снова облучают окаменелости УФ-лучами, убивая вирусы и бактерии, прилипшие к внешнему слою, прежде чем соскрести этот слой в качестве ещё одной меры стерильности. Затем с помощью дрели получают доступ к внутренней части кости, генерируя мелкий порошок.
Когда учёные извлекают ДНК из древних образцов, они надевают так называемые «комбинезоны-кролики» и маски N95, чтобы их собственная ДНК не смешалась с образцом.
«Мы берём порошок и, скрестив пальцы, надеемся, что в нём есть клетки, содержащие фрагменты ДНК», — говорит Шафер.
Иногда внешние источники ДНК бывают полезны.
Изоляция ДНК
После того как исследователи получают свой «ДНК-порошок», пора его изолировать. В порошок также попадают белки и другие вещества, не являющиеся ДНК. Для исследования Раскован использовал химические реагенты, чтобы растворить ненужные вещества, оставив ДНК, которую он искал. Затем раствор смешали с кремниевым порошком, который имеет положительный заряд, и перемешали с помощью центрифуги.
«У нити ДНК множество отрицательных зарядов, — говорит Раскован. — Это значит, что если у вас есть что-то с положительным зарядом, оно может работать как магнит». Этот магнетизм помогает нитям ДНК прилипать к кремнию, чтобы затем их можно было прочитать.
Оцифровка ДНК с помощью современных машин
Затем физическую ДНК необходимо оцифровать, чтобы её можно было проанализировать. Хотя на рынке есть несколько секвенаторов, Раскован говорит, что наиболее распространённым является машина от компании Illumina.
Эти машины уже имеют библиотеку искусственно созданных молекул ДНК, которые называются адаптерами и которые они могут распознать. Эти адаптеры, которые настолько малы, что их измеряют в ангстремах (одна миллиардная часть метра), затем смешивают с исходным образцом. Адаптеры действуют как метки, чтобы машина Illumina могла прочитать нити ДНК, с которыми они связываются.
ДНК состоит из миллиардов пар строительных блоков, называемых нуклеотидами. Секвенатор действует как своего рода камера, делая снимки образцов и используя адаптеры для идентификации пар оснований и составления их в текстовый файл. Строительные блоки жизни теперь преобразованы в цифровые данные, которые можно просматривать, сортировать, анализировать и сравнивать.
Древняя ДНК может быть сложной для работы
Хотя секвенирование ДНК сейчас имеет широкий спектр применения, от криминалистической экспертизы до медицинских исследований, работать с более старыми образцами, где нити ДНК могут быть повреждены или неполными, может быть особенно сложно. К счастью, ДНК относительно мало изменилась за миллионы лет. Для исследований Шафера это означало, что можно использовать химические реакции, чтобы заполнить или исправить любые отсутствующие или повреждённые части.
«Если бы вы посмотрели на один и тот же участок ДНК в свежем образце и в древнем образце, вы бы обнаружили, что некоторые пары оснований в древнем образце отличаются, — говорит Шафер. — Это ваш ключ к тому, что с ними произошло что-то неестественное».
Есть только одна проблема: секвенатор анализирует всю ДНК в образце, независимо от того, ищет ли её исследователь. Для Раскована это означает, что в образце может быть ДНК солдат, а для Шафера — ДНК любых микробов, которые попали в окаменелость Torontoceros, наряду с любыми другими источниками ДНК, которые могли попасть в образцы во время их пребывания в земле.
Раскован сравнил процедуру с тем, как если бы вы взяли кучу книг, вырвали из них страницы, перемешали их все и попытались выяснить сюжет одной из них. Оцифровка нитей означает, что каждый фрагмент ДНК можно сравнить со всей базой данных, чтобы определить не только то, какие фрагменты действительно актуальны, но и то, как они соотносятся с известными животными, бактериями и вирусами.
Для Раскована это означало сравнение нитей с ДНК болезнетворных бактерий, таких как тиф, чтобы определить, что стало причиной гибели солдат Наполеона более 200 лет назад. Для Шафера это дало ему возможность определить, какое место Torontoceros занимает на «древе жизни», сравнив древнюю ДНК с современными животными, такими как олени и карибу.
И Раскован, и Шафер признают, что наряду с поистине ошеломляющими технологиями есть ещё один ключевой ингредиент их успеха: удача. Если пройдёт слишком много времени или образцы будут захоронены в условиях, которые будут слишком тёплыми или влажными, ДНК, которую они ищут, может деградировать до состояния бесполезности. Однако технологии постоянно совершенствуются, и секвенирование может быть применено ко всё большему количеству образцов с течением времени.
«Методы стали намного лучше, — говорит Шафер. — Есть исследование, в котором была идентифицирована ДНК из окаменелостей миллионной давности. Если ДНК есть, если она хорошо сохранилась, мы можем её извлечь».