В прошлом году мы отметили 50 лет с момента публикации первых статей по флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС). Это событие не сопровождалось массовыми гуляньями, но стало поводом для тихого восхищения среди специалистов, ведь ФКС — один из фундаментальных методов, который продвинул наше понимание многих процессов на молекулярном уровне.
Основы ФКС
ФКС начала активно применяться с появлением конфокальных микроскопов в 1990-х годах. С тех пор метод используется для изучения химических реакций, образования агрегатов, молекулярных движений в клетках и прикрепления молекул к мембранам.
Принцип работы ФКС заключается в записи данных из очень маленького объёма — около фемтолитра (одна квадриллионная часть литра, меньше, чем зерно песка в олимпийском бассейне). В классической форме ФКС использует конфокальный микроскоп для создания такого малого объёма измерения.
Когда молекул, способных флуоресцировать, очень мало, сигнал становится очень шумным. Однако можно связать увеличение сигнала с приходом молекул в объём, химическими реакциями или присоединением к поверхностям.
Автокорреляция и её анализ
Одним из способов обработки сигналов ФКС является расчёт автокорреляции. Автокорреляция показывает вероятность увидеть повышенный сигнал через некоторое время после наблюдения всплеска флуоресценции.
С годами развитие ФКС научило нас читать автокорреляции как отпечаток пальца — они показывают, наблюдаем ли мы простое молекулярное движение, химические реакции, частицы разных размеров или частицы, которые взаимодействуют друг с другом. Однако существует серьёзная проблема с анализом этих автокорреляций. Проблема статистическая: поскольку все значения автокорреляции получены из одного эксперимента, они не являются по-настоящему независимыми измерениями.
Новый метод — FITSA
Группа учёных из Эстонии разработала новый метод, основанный на прямом анализе флуоресцентного сигнала. Они продемонстрировали, что новый метод — статистический анализ следов интенсивности флуоресценции (FITSA) — очень надёжен и не требует точных знаний о свойствах молекул перед экспериментом.
Особенно интересен количественный анализ того, насколько меньше данных требуется для оценки молекулярных свойств с помощью FITSA по сравнению с классической ФКС. Даже при использовании ФКС в неправильном режиме FITSA требовала в несколько раз меньше данных, чем ФКС. При сравнении с ФКС, применённой должным образом, различия становятся ошеломляющими: FITSA требует от 300 до 21 000 раз меньше данных, чем ФКС.
Исследователи предполагают, что FITSA и методы, основанные на аналогичных подходах, заменят классические конвейеры анализа ФКС во всех их приложениях в области наук о жизни и материаловедении.
Благодаря таким огромным различиям FITSA открывает новые возможности для изучения этих процессов с научной строгостью, которая раньше была невозможна.