Углеводы — это не только компоненты пищи. Маленькие, но структурно сложные углеводы служат элементами клеточных стенок и играют важную роль в межклеточных взаимодействиях.
Учёные могут быстро и надёжно создавать множество биомолекул, от ДНК до белков, с помощью автоматизированных инструментов. Однако на протяжении десятилетий у них были серьёзные трудности с синтезом небольших углеводов.
Исследователи из Университета Калифорнии в Санта-Барбаре и Института коллоидов и интерфейсов Макса Планка (MPIKG) обнаружили способ избирательного создания связей, соединяющих отдельные сахара в короткоцепочечные углеводы, называемые олигосахаридами.
Новая методика позволяет точно контролировать стереохимию, или хиральность, соединительных связей между молекулами сахара. Команда успешно использовала этот метод для построения сахарных цепей на автоматизированном инструменте.
Их результаты, опубликованные в Nature Synthesis, предоставят биологам и биохимикам доступ к олигосахаридам, которые ранее было трудно синтезировать. Это, в свою очередь, может открыть новые направления биомедицинских исследований этих универсальных молекул.
«Священный Грааль в химии углеводов — это универсальный синтетический метод. И мы приближаемся к нему», — сказал старший автор Лиминг Чжан, профессор химии в UCSB.
Олигосахариды — это углеводы, состоящие из трёх-десяти молекул сахара (моносахаридов), соединённых вместе. Они не являются структурными углеводами, такими как целлюлоза или хитин. И не накапливают энергию, как крахмал. Они часто встречаются на поверхности клеток, где играют решающую роль в межклеточной коммуникации и передаче сигналов, вирусных и бактериальных инфекциях, модуляции иммунной системы и процессах развития.
Несмотря на относительно небольшой размер, структуры олигосахаридов далеко не просты. Они имеют вариации между своими компонентами, местами соединения и хиральностью соединительных связей.
Учёные подсчитали, что может существовать более 100 миллионов видов пятикомпонентных олигосахаридов. И это усложняет их синтез: получение точного контроля над пространственной ориентацией этих связей, несмотря на структурную сложность.
Химическая реакция с одинаковой вероятностью может привести к образованию как левосторонней, так и правосторонней связи. «Таким образом, при создании связей между сахарами вы часто получаете смесь конфигураций/хиральности», — объяснил Чжан.
В отличие от этого, различные строительные блоки, из которых состоят белки и нуклеиновые кислоты, связываются только одним способом, без выраженной хиральности. И они никогда не разветвляются, пояснил соавтор Питер Зеебергер, учёный из MPIKG.
Поскольку каждая связь между сахарами может принимать одно из двух пространственных положений, перестановки олигосахарида растут экспоненциально с его размером. Существует более 2000 возможностей для одной и той же молекулы, состоящей из 10 сахаров. «Это делает нестереоселективную химию бесполезной», — сказал Чжан.
К сожалению, выделение многих олигосахаридов из природы также неосуществимо. Когда учёные расщепляют их, они получают сложную смесь похожих молекул, которую практически невозможно выделить, объяснил Чжан.
Поэтому, если учёные хотят получить олигосахарид, они должны его синтезировать. Ферменты весьма эффективны для производства специфических молекул, но они обычно ограничены определёнными реагентами. Эволюция ферментов требует времени и денег, поэтому они не идеальны для ранних этапов исследований.
Основная задача химического синтеза — просто отделить продукт от всех побочных продуктов и отходов. Это может потребовать много растворителя и фильтрующего материала, что увеличивает трудозатраты, количество отходов и стоимость производства, сказал Чжан. Поэтому авторы решили разработать химию, подходящую для твердофазного синтеза, где процесс проводится с одним концом, закреплённым на полимерной подложке.
Таким образом, они могут создавать олигосахарид по частям, зная, что только желаемый продукт будет прикреплён к опорной структуре, когда они промывают аппарат между этапами.
Развитие твердофазного синтеза пептидов принесло его изобретателю Нобелевскую премию по химии 1984 года и с тех пор стало рутинным в синтезе олигонуклеотидов. Зеебергер впервые применил этот процесс для синтеза углеводов в 2001 году и совершенствовал его в течение последних 25 лет.
Поведение молекулы зависит не только от состава, но и от формы. Поэтому одна и та же молекулярная формула может иметь множество различных расположений, или изомеров. Учёные могут надёжно создать определённую ориентацию, когда один простой сахар соединяется с другим. Но контроль ориентаций в широком диапазоне сценариев связывания с помощью одного объединяющего подхода остаётся весьма сложной задачей и пока недостижим.
Чтобы решить эту задачу, лаборатория Чжана использовала реакцию, называемую бимолекулярным нуклеофильным замещением (SN2). Это одностадийный процесс, при котором новый сахар поступает в растущий олигосахарид в то же время, когда отходящий компонент отрывается.
В результате новый сахар может подойти только в одной ориентации: с уходящей компонентой, обращённой в сторону. Этот процесс SN2 позволяет химикам надёжно контролировать ориентацию связывания широко применяемым образом.
Но заставить приход и уход происходить одновременно очень сложно в контексте структурной сложности олигосахаридов. Поэтому команда добавила направляющую молекулу к уходящей группе. Это помогает реакции, способствуя атаке входящего сахара до того, как уходящая группа отделится слишком рано.
Этот направленный подход SN2 работает для многих типов связей между сахарами, которые лаборатория Чжана исследовала до сих пор, а также для реакций в растворе и твердофазной химии. Его можно проводить в условиях, которые не являются ни особенно кислотными, ни основными. Более того, автоматизированный твердофазный синтез не требует от техника наличия специальной подготовки.
Это достижение является долгожданным. «Разработка стереоселективного гликозилирования ведётся с начала XX века», — сказал Зеебергер. Лаборатория Чжана начала свою работу над этой задачей в 2018 году.
Автоматизированный синтез олигосахаридов принесёт наибольшую пользу нехимикам. Сейчас, если биолог хочет получить определённый олигосахарид, ему придётся нанять подрядчика для ручного синтеза соединения, что может занять месяцы и стоить дорого.
«Идея состоит в том, что вы можете выполнять этот итеративный процесс с помощью машины, и эта машина может автоматически синтезировать его», — сказал Чжан. Зеебергер основал компанию, которая предлагает как услугу, так и машину, на которой она работает, обеспечивая прямой путь для применения.
Учитывая стоимость техники, авторы ожидают, что она найдёт наибольшее применение в биомедицинских исследованиях. «Среди этих приложений — диагностические тесты для аутоиммунных заболеваний и вакцины для предотвращения внутрибольничных бактериальных и грибковых инфекций», — сказал Зеебергер.
Методология идеально подходит для ранних экспериментов, когда учёным может потребоваться лишь небольшое количество вещества для изучения его потенциала. Как только исследователи найдут многообещающий олигосахарид, они смогут инвестировать в ферментативные или химико-ферментативные подходы для его более эффективного синтеза.
Техника гликозилирования Чжана уже работает с широким спектром сахаров и может производить широкий спектр различных структур. Однако он планирует протестировать её на более необычных сахарах. Сахара, производимые эукариотами, составляют лишь небольшую часть тех, которые производятся бактериями, объяснил он, и многие из них важны для биологических и медицинских исследований.
Существует также одна конкретная связь, так называемая «бета-маннозидная» связь, которая до сих пор остаётся нерешённой. «Наши команды попытаются решить эту задачу», — сказал Зеебергер.
Решение таких задач, как автоматизированный синтез олигосахаридов, имеет решающее значение для более прикладных прорывов. Захватывающие разработки, такие как новые лекарства от рака, вакцины широкого спектра действия и более эффективные антибиотики, невозможны без достижений в базовых методологиях.
«Разрабатывая эту химию, мы открываем гораздо больше возможностей», — сказал Чжан.
Предоставлено Университетом Калифорнии в Санта-Барбаре.