Около 350 000 химических веществ, как ожидается, будут коммерчески доступны по всему миру. Мало что известно о том, какие химические вещества потенциально нейротоксичны, то есть вредны для (развивающегося) мозга. На сегодняшний день эффективных методов тестирования не хватает.
Исследовательская группа из Центра экологических исследований им. Гельмгольца (UFZ) разработала подход к скринингу, основанный на модели эмбриона данио-рерио, который позволяет проводить высокопроизводительное тестирование на нейротоксичность без необходимости проведения традиционных экспериментов на животных.
В исследовании учёные обнаружили нейротоксические эффекты и лежащие в их основе молекулярные механизмы химического вещества хлорофена. Исследование было опубликовано в журнале Environmental Health Perspectives.
«На сегодняшний день только около 200 веществ по всему миру были протестированы на нейротоксические эффекты в рамках официальных регуляторных исследований», — говорит экотоксиколог UFZ доктор Давид Лейтхольд, ведущий автор исследования. «Причина этого в том, что эти процедуры тестирования сложны, трудоёмки и дороги. Кроме того, существует этический аспект, поскольку эти исследования проводятся преимущественно на крысах и мышах».
Чего не хватает, так это быстрого и экономически эффективного метода скрининга, который мог бы быстро и надёжно выявлять нейротоксические эффекты химических веществ и сложных химических смесей без необходимости проведения традиционных экспериментов на животных. И именно здесь на помощь приходит исследование UFZ, чтобы восполнить этот пробел.
Команда UFZ использовала модель эмбриона данио-рерио, которая широко применяется в токсикологических исследованиях. Одним из преимуществ этой модели является то, что около 70% генов, обнаруженных у данио-рерио (Danio rerio), также обнаружены у человека. Поэтому результаты, полученные на модели эмбриона данио-рерио, вероятно, могут быть применены к человеку. Кроме того, эмбрионы данио-рерио хорошо подходят для высокопроизводительных приложений благодаря своему небольшому размеру и быстрому развитию, что позволяет получить ценные сведения о функционировании нервной системы.
Используя модель данио-рерио, исследователи разработали процедуру скрининга, которая позволяет быстро тестировать химические вещества на нейротоксические эффекты, включая выявление химических веществ, нарушающих процессы обучения и памяти.
«Мы используем по сути одну из простейших форм обучения: привыкание к повторяющемуся стимулу», — объясняет Лейтхольд. «Если слышен акустический сигнал, он вызывает рефлекс испуга или бегства. Однако если его слышат неоднократно, рыба привыкает к нему и в конечном итоге перестаёт реагировать на неопасный стимул».
Чередование световых и тёмных стимулов также приводит к изменению поведения рыбок данио-рерио при плавании. Исследователи объединили акустические и визуальные стимулы с точки зрения частоты, порядка, временной последовательности, продолжительности и интенсивности, разработав таким образом определённую процедуру тестирования.
Первоначально они протестировали этот метод, используя химические вещества, влияние которых на поведение данио-рерио по отношению к визуальным или акустическим сигналам было известно.
«Нейротоксичные вещества могут иметь самые разные эффекты. Некоторые, например, мешают эмбрионам рыб привыкать к акустическому стимулу, вызывая повторное срабатывание их рефлекса бегства. Другие вещества могут привести к тому, что привыкание происходит гораздо быстрее. Кроме того, могут быть изменены другие визуальные и акустические модели поведения», — объясняет Лейтхольд.
Используя известные вещества, мы смогли создать своего рода поведенческий отпечаток, который затем можно использовать для того, чтобы сделать выводы о том, как химическое воздействие нарушает функцию нервной системы.
Используя свою платформу с данио-рерио, исследователи затем протестировали десять выбранных веществ, известных тем, что они влияют на систему рецепторов (NMDAR), которая играет особую роль в обучении и памяти. О том, проявляют ли они нейротоксические эффекты у данио-рерио, ранее не было известно.
«С помощью нашего подхода к скринингу мы смогли продемонстрировать значительное влияние на поведение в процессе обучения для шести веществ. Поэтому они явно проявляли нейроактивный эффект», — говорит Лейтхольд.
Особое внимание исследователей привлекло одно вещество: хлорофен, химическое вещество, принадлежащее к группе биоцидов. В отличие от других веществ, хлорофен не привёл к более быстрому привыканию к акустическим стимулам, но полностью заблокировал обучение.
Под влиянием хлорофена эмбрионы рыб всё ещё реагировали на акустические стимулы, но не на визуальные. «Это явление называется парадоксальным возбуждением и возникает при приёме некоторых наркотических веществ», — говорит Лейтхольд. Ранее было неизвестно, что хлорофен может иметь такой эффект, поэтому исследователи хотели дополнительно изучить лежащий в его основе механизм действия.
Они наткнулись на исследование американских коллег, в котором наркотические вещества тестировались на модели данио-рерио. Исследование показало, что парадоксальное возбуждение может опосредоваться специфическими рецепторами (GABAA), которые играют важную роль в нашей центральной нервной системе и имеют решающее значение для контроля поведения.
Лейтхольд говорит: «Когда рецепторы GABAA были заблокированы, эмбрионы рыб, подвергшиеся воздействию хлорофена, восстановили свою способность реагировать на визуальные стимулы. Однако блокировка рецепторов не могла обратить вспять изменённое поведение в процессе обучения. Мы узнали, что у хлорофена есть несколько молекулярных механизмов».
Но сначала исследователи хотели подтвердить свою гипотезу относительно механизма действия хлорофена через рецепторы GABAA с помощью дополнительных тестов. Для этого они использовали нейроны, выделенные из мышей, и модели человеческих нейронных клеток.
В сотрудничестве с коллегами из Лейпцигского университета и Института окружающей медицины им. Лейбница в Дюссельдорфе исследователи смогли продемонстрировать, что хлорофен также действует через рецепторы GABAA. Компьютерные модели, соответствующие химической структуре с возможными рецепторами, также предсказывали связывание с рецепторами GABAA. Таким образом, был доказан механизм действия хлорофена через рецепторы GABAA.
Но как насчёт другого механизма действия хлорофена, который изменяет поведение в процессе обучения? Может ли за этим стоять вышеупомянутая система NMDA-рецепторов? Дальнейшие исследования показали, что хлорофен, вероятно, не взаимодействует напрямую с рецептором. В исследовании, проведённом в США, при тестировании наркотических веществ на модели данио-рерио учёные обнаружили доказательства существования другой системы рецепторов, которая может играть роль в парадоксальном возбуждении: определённые калиевые каналы.
«Итак, мы пришли к идее протестировать обезболивающее флупиртин, который действует через эти калиевые каналы, на нашей платформе с данио-рерио», — объясняет Лейтхольд. «И действительно — флупиртин вызывал почти те же модели поведения, что и хлорофен, включая снижение способности к обучению. Хлорофен, по-видимому, действует очень похожим, если не идентичным образом через эти калиевые каналы».
Исследователи надеются, что их подход к скринингу поможет тестировать химические вещества и химические смеси на нейротоксические эффекты в больших масштабах — быстро, экономически эффективно и без необходимости проведения традиционных испытаний на животных, чтобы риски для человека и окружающей среды можно было выявить на ранней стадии.
«Наша платформа с данио-рерио соответствует Стратегии ЕС в отношении химических веществ и концепции Европейского зелёного курса, поскольку она может выявлять опасные химические вещества на ранней стадии, до того, как они нанесут вред», — говорит Лейтхольд.
Профессор доктор Тамара Таль, возглавляющая рабочую группу в UFZ, где проводилось исследование, подчёркивает: «Регулирующие органы, как правило, скептически относятся к использованию данных о токсичности, полученных на данио-рерио, для разработки химических норм для человека. Когда мы демонстрируем, что способ, которым эти химические вещества нарушают развитие и функционирование мозга, специфически сохраняется у данио-рерио, мышей и человека, мы укрепляем доверие к использованию данных о поведении данио-рерио для заполнения огромной пустоты в тестировании нейротоксичности и, в конечном итоге, для улучшения здоровья человека за счёт снижения вредного воздействия нейротоксичных химических веществ».
Предоставлено Центром экологических исследований им. Гельмгольца.