Способность протеинкиназ переносить фосфатную группу на целевые белки играет важную роль во многих клеточных процессах. Учёные из Института медицинских исследований Общества Макса Планка в Гейдельберге разработали новый молекулярный инструмент, который может отслеживать активность киназ как в пространстве, так и во времени. Это позволяет исследовать связь между активностью киназ и клеточными фенотипами в гетерогенных популяциях клеток и in vivo.
Новый регистратор назван Kinprola и основан на механизме, который запускается при воссоединении двух разделённых фрагментов самомаркирующегося белка HaloTag. Самомаркирующиеся белки имеют способность отмечать себя цветом.
В присутствии флуоресцентного субстрата HaloTag и специфической активности киназы Kinprola становится маркированной. Активность киназы контролирует интенсивность маркировки, в то время как флуоресцентный субстрат определяет время записи.
Учёные разработали регистраторы для четырёх протеинкиназ. Публикация исследования в журнале Nature Chemical Biology сосредоточена в основном на протеинкиназе А (PKA).
Протеинкиназы, важная подгруппа киназ, контролируют большинство клеточных процессов. Их активность имеет решающее значение для нормальных клеточных процессов, тогда как аномальная активность киназ связана со многими заболеваниями.
«Мы хотели найти способ записи активности киназ масштабируемым образом и с высоким разрешением, без ограничений оптической визуализации. Под микроскопом наблюдения обычно ограничиваются визуализацией в реальном времени относительно небольшого количества клеток и не всегда применимы к глубоким тканям», — говорит Де-эн Сун, который возглавлял проектную группу вместе с Каем Джонссоном, директором Института медицинских исследований Общества Макса Планка.
С помощью своего молекулярного регистратора Kinprola учёные из Института Макса Планка нашли способ преодолеть ограничения оптической записи в реальном времени. Они используют молекулярный переключатель, зависящий от фосфорилирования, процесса, катализируемого киназами.
Когда эта киназа активируется, запись инициируется путём промывки флуоресцентным субстратом, что позволяет маркировать активированные белки Kinprola. Запись прекращается путём вымывания субстрата. Маркированная популяция Kinprola остаётся стабильной с течением времени, в то время как остальная часть пула белков Kinprola остаётся немаркированной.
Эта процедура позволяет разделить запись и анализ, используя различные методы визуализации и проточную цитометрию — метод, который позволяет анализировать и сортировать физические и химические свойства клеток или других частиц в зависимости от эксперимента. Она преобразует временную активность киназ в стабильный флуоресцентный сигнал и характеризуется высокой универсальностью и масштабируемостью.
Kinprola работает для нескольких киназ и функционирует in vivo. Например, в мозге мышей Kinprola может регистрировать активацию PKA, повышенную путём инъекции препарата.
Предоставлено:
Max Planck Society