Профессор Хирохидэ Сайто (Department of Life Science Frontiers at CiRA / The University of Tokyo) и доцент Хирохиса Оно (Department of Life Science Frontiers at CiRA) возглавили команду, разработавшую новую систему на основе РНК под названием «расщеплённый RNA-переключатель». Эта система объединяет трансляционный и посттрансляционный контроль для достижения высокоспецифичной экспрессии генов в целевых типах клеток. Их исследование опубликовано в журнале Nature Communications.
Что такое RNA-переключатель?
RNA-переключатель — это синтетическая молекула мРНК, предназначенная для регуляции трансляции гена в ответ на специфические внутриклеточные сигналы, такие как микроРНК (miRNAs) или белки. Эти переключатели действуют как программируемые молекулярные логические элементы, которые могут включать или выключать экспрессию генов в зависимости от наличия целевых биомолекул. Однако обычные RNA-переключатели часто страдают от низкого соотношения сигнала к шуму из-за «протекающей» трансляции и сложности идентификации уникальных молекулярных маркеров для конкретных типов клеток.
Как работает расщеплённый RNA-переключатель?
Чтобы преодолеть эти ограничения, исследовательская группа внедрила расщеплённый RNA-переключатель, который использует сплайсинг белков для интеграции выходных сигналов от нескольких RNA-переключателей. Эта система использует расщеплённые интеины — фрагменты белка, которые соединяются посттрансляционно, образуя функциональный белок только тогда, когда присутствуют оба фрагмента.
Соединяя ON-переключатели, которые кодируют N- и C-концевые фрагменты белка, с OFF-переключателями, которые производят неактивные фрагменты, система подавляет непреднамеренную экспрессию белка в нецелевых клетках. Эта стратегия позволила улучшить соотношение сигнала к шуму у miRNA-чувствительных переключателей более чем в 25 раз.
Демонстрация универсальности
Исследователи продемонстрировали универсальность расщеплённого RNA-переключателя в различных приложениях, включая:
* флуоресцентные репортёры для визуализации;
* гены устойчивости к антибиотикам для селекции клеток;
* суицидный ген HSV-TK для индукции гибели клеток.
В каждом случае система обеспечивала контроль над конкретным типом клеток на основе эндогенной активности микроРНК.
Команда также применила расщеплённый RNA-переключатель к платформе редактирования генома CRISPR-Cas9, что позволило проводить miRNA-зависимое редактирование генов в клетках человека, включая ИПСК (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки). В модели клеточного заболевания мышечной дистрофии Дюшенна система достигла более чем 45-кратной специфичности при редактировании гена дистрофина, минимизируя нецелевые эффекты.
Расширение возможностей
Для дальнейшего расширения возможностей исследователи создали мультивходные логические элементы, используя ортогональные расщеплённые интеины. Эти схемы могут обнаруживать комбинации микроРНК и белков, обеспечивая сложное внутриклеточное принятие решений. Впервые был успешно продемонстрирован трёхвходовой логический элемент И, использующий только компоненты РНК, активирующий экспрессию гена только при наличии всех трёх целевых микроРНК.
Кроме того, система с тумблером, использующая два флуоресцентных белка, улучшила бинарное разделение клеточных популяций в проточной цитометрии, повысив точность классификации по сравнению с обычными RNA-переключателями.
Это исследование — первое, в котором объединяются трансляционная регуляция на основе мРНК и посттрансляционный сплайсинг белков. Расщеплённый RNA-переключатель предлагает модульную, масштабируемую платформу только для РНК для точного контроля генов с большим потенциалом для генной терапии, регенеративной медицины и синтетической биологии. Этот подход открывает новые возможности для разработки «интеллектуальных» РНК-терапевтических средств и закладывает основу для лечения следующего поколения, способного адаптироваться к сложным клеточным средам.
Предоставлено:
[Киотский университет](https://www.kyoto-u.ac.jp/en/)