Высокотехнологичные обновления позволяют учёным изучать генетику миллионов отдельных клеток, значительно снижая при этом затраты по сравнению с традиционными подходами.
Центр геномики Южной Австралии (SAGC) стал первым сертифицированным поставщиком услуг в Азиатско-Тихоокеанском регионе для технологии Evercode от Parse Bioscience.
Платформа Evercode присваивает уникальный «штрих-код» РНК отдельных клеток в сложном образце. Уровень экспрессии генов в каждой клетке можно определить с помощью секвенсора MGI DNBSEQ-T7 от SAGC — самой быстрой и эффективной платформы для секвенирования в Австралии.
Этот метод, известный как «секвенирование РНК отдельных клеток» (scRNA-seq), позволяет получить важную информацию о различных типах клеток, их состояниях, функциях и сигнатурах заболеваний в образце.
Доктор Мунир Икбал, научный сотрудник SAGC в области одноклеточной и пространственной транскриптомики, рассказывает, что в отличие от традиционных методов на основе капель, которые полагаются на дорогие специально разработанные микрофлюидные чипы, наборы для секвенирования отдельных клеток Evercode не требуют инвестиций в высокотехнологичное оборудование.
«Он поставляется в виде готового набора… штрих-коды загружаются в обычные стандартные планшеты на 96 лунок. Все реагенты находятся в пробирке. Всё, что вам нужно, — это лабораторный стол и многоканальная пипетка», — объясняет он.
Менеджер по работе с партнёрами SAGC Джоэл Бэйт говорит, что новый подход значительно снизил стоимость проведения scRNA-seq.
«За 2 года мы прошли путь от… профилирования одной клетки за 50 центов, теперь мы опустились до менее чем 10 центов — 7 центов, как я подсчитал в нашем последнем проекте. Бюджеты на исследования ограничены. Поэтому, если вы можете [секвенировать] в 5 раз больше образцов за те же деньги, масштаб этих проектов просто растёт, что очень хорошо».
Центр геномики Южной Австралии (SAGC) был основан в 2020 году для поддержки исследований в области геномики по всей Австралии.
Когда исследователи в области биологических наук нуждаются в секвенировании генетической информации внутри клеток, включая ДНК, РНК и эпигенетику, они обращаются в SAGC.
«С ДНК вы хотите точно прочитать ДНК. Количественная оценка менее важна, потому что каждая клетка имеет полный набор генома», — объясняет Бэйт.
ДНК, упакованная в хромосомы в ядре клетки, кодирует генетические инструкции для производства белков. РНК действует как посланник, передавая эту информацию за пределы ядра, где её могут считывать рибосомы для производства белков.
«С РНК количественная оценка действительно важна, потому что вы хотите понять, когда гены активируются или подавляются», — говорит Бэйт.
Доктор Мунир Икбал (слева) и Джоэл Бэйт (справа) с секвенатором MGI DNBSEQ-T7 от SAGC.
Традиционно уровень экспрессии генов измерялся в совокупности, фиксируя всю матричную РНК (мРНК) в образце. Но массовое секвенирование РНК (RNA seq) может показать только среднюю экспрессию генов во всех клетках.
«RNA-seq — это хорошая, всё ещё очень стандартная технология. Но она маскирует эффект генов с низкой экспрессией», — говорит Икбал. Он также не может показать детальные сведения, например, как типы клеток в образце по-разному экспрессируют гены.
«Теперь мы можем делать это на уровне отдельных клеток», — говорит Бэйт. «Вы можете увидеть, что «этот тип клеток чрезмерно экспрессирует этот конкретный ген».
Он добавляет, что редкие типы клеток, которые могут составлять всего 0,1% образца, также представляют большой интерес. «Но если вы смотрите только на 10 000 клеток, что было удивительным прорывом [для scRNA-seq] всего 3 года назад, этих цифр будет недостаточно».
Технология Evercode использует подход, называемый «комбинированным штрихкодированием с разделённым пулом», который позволяет SAGC обрабатывать от нескольких тысяч клеток до 5 миллионов.
Работает это так.
Сначала до 96 образцов загружают в планшет на 96 лунок. В каждую лунку добавляется уникальный молекулярный «штрих-код», который прикрепляется к поверхности всех клеток и помечает их как принадлежащие к этому образцу. Затем образцы объединяют, а клетки перераспределяют по другому планшету на 96 лунок. В каждую лунку добавляется второй уникальный штрих-код поверх первого — как звенья в цепи.
Уже после двух таких раундов получается 9 216 (96 х 96) возможных комбинаций штрих-кодов, что позволяет индивидуально идентифицировать до такого количества клеток. Если процесс повторить ещё раз, это число увеличится до 884 736. После 4 раундов потенциальное количество уникальных комбинаций достигает почти 85 миллионов.
Затем клетки разрушают, чтобы высвободить мРНК, которая прикрепляется к концам штрих-кодов на поверхности клетки. Этот штрих-код, который можно прочитать во время секвенирования, отмечает мРНК как происходящую из этой клетки.
Но есть проблема. В отличие от прочной двухцепочечной ДНК, РНК одноцепочечная. «Она нестабильна. Быстро разрушается. Чувствительна к температуре», — говорит Икбал.
«Происходит следующее: мы всё ещё изучаем РНК, но не помещаем РНК физически на секвенатор».
Вместо этого фермент (обратная транскриптаза) преобразует одноцепочечную мРНК в комплементарную ДНК (кДНК), которая кодирует ту же информацию, но в форме двухцепочечной ДНК.
Затем кДНК можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), чтобы получить достаточно материала для секвенирования. кДНК фрагментируют на более удобные для чтения отрезки, а на концы нитей добавляют «адапторы», чтобы фрагменты можно было прочитать с помощью технологии секвенирования.
Центр SAGC уже поддерживал проекты учреждений по всей Австралии и Новой Зеландии, используя эту платформу.
«У каждой исследовательской группы есть свой биологический вопрос», — говорит Икбал. «Один работает над аспектом поиска маркеров рака. Другой работает над поиском мишеней для лекарств от конкретного заболевания. Третья группа работает над изучением иммунологического ответа на определённую вакцину.
«Суть технологии не меняется», — добавляет менеджер центра SAGC доктор Сен Ван. «Мы предоставляем исследователям инструменты для изучения биологии на беспрецедентном уровне — по одной клетке за раз».