Представьте, что вы сидите у пруда и слушаете кваканье лягушек. Вы хотите узнать, сколько лягушек в пруду, но не можете различить отдельные звуки — только общий шум, который то нарастает, то стихает по мере того, как лягушки начинают и прекращают общаться.
Но что, если бы вы могли изучить эти изменения громкости, чтобы определить количество лягушек в пруду? Именно такая идея лежит в основе [нового метода](https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.4c06304), разработанного в лаборатории Фанке в Джанелиа для подсчёта отдельных молекул, содержащихся в одном пятне света, обнаруженном с помощью флуоресцентного микроскопа. Это важно для понимания биологии живых систем. Статья опубликована в журнале Nano Letters.
Точно так же, как кваканье лягушек у пруда, одно пятно света, захваченное флуоресцентным микроскопом, состоит из множества отдельных элементов — в данном случае флуоресцентно меченных молекул.
Разрешение микроскопа ограничено физикой света и самой системой, поэтому прибор может фиксировать только сумму этих отдельных вкладов — их общую яркость. Как громкость кваканья у пруда, составное пятно меняется по интенсивности со временем, когда молекулы включаются и выключаются.
Чтобы создать свой новый метод, команда сначала смоделировала весь путь света через систему — от фотонов, покидающих флуорофор, до создания пятна, обнаруженного микроскопом. На основе этого они создали «трассировку» или график интенсивности пятна во времени, зависящий от всех параметров системы, как известных, так и неизвестных.
Вооружившись этой [моделью машинного обучения](https://phys.org/tags/machine+learning+model/), исследователи затем приступили к определению неизвестных параметров на фактическом изображении пятна света, обнаруженного микроскопом. Для этого они сопоставили свою модель с трассировкой интенсивности этого пятна во времени.
Регулируя параметры своей модели для воспроизведения реальной трассировки, они смогли определить неизвестные величины, включая количество отдельных молекул, содержащихся в одном пятне.
В отличие от предыдущих методов подсчёта, которые дают одно число отдельных молекул, содержащихся в пятне, новый метод, blinx, даёт вероятностное распределение всех возможных ответов. Это позволяет исследователям увидеть достоверность предсказаний модели и решить, нужны ли им дополнительные данные.
«Иногда данные просто не поддерживают однозначный ответ. Может быть так много колебаний, что информации просто нет», — говорит руководитель группы в Джанелиа Ян Фанке. «Эта модель может сказать вам: я действительно не знаю».
Blinx также может подсчитывать больше отдельных молекул, чем аналогичные методы, что делает его потенциально полезным для идентификации отдельных белков в образце, по словам исследователей. Белки состоят из различного количества разных аминокислот, поэтому возможность обнаружить точное количество нескольких ключевых аминокислот может помочь определить, какие белки присутствуют.
Фанке говорит, что надеется, что не только биологи начнут использовать blinx, но и другие исследователи улучшат новый метод. «Я думаю, что это закладывает основу для нового поколения подобных алгоритмов», — говорит он.
Исследователи говорят, что разработка blinx потребовала усилий исследовательского института, такого как Джанелиа. «Это супер амбициозный проект: есть относительно низкая вероятность того, что всё получится, и для этого требуется много междисциплинарных знаний», — говорит Алекс Хиллсли, бывший научный сотрудник лабораторий Фанке и Стерна, который руководил проектом. «Вам нужен кто-то, кто действительно разбирается в химии, вам нужен кто-то, кто действительно разбирается в визуализации сверхразрешения, вам нужен кто-то, кто действительно разбирается в моделировании, и я не могу представить, чтобы всё это объединилось, кроме как в таком месте, как Джанелиа».
Предоставлено [Howard Hughes Medical Institute](https://phys.org/partners/howard-hughes-medical-institute/).
new method developed by the Funke Lab at Janelia to count the individual molecules contained in a single spot of light detected by a fluorescence microscope—a quantity important for understanding the underlying biology of a living system. The paper is published in the journal Nano Letters.”,”Just like the chatter of the frogs at the pond, one spot of light captured by a fluorescence microscope is made up of many individuals—in this case, fluorescently labeled molecules.”,”The resolution of the microscope is limited by the physics of light and the system itself, so the instrument can only detect the sum of these individual contributions—their combined brightness. Like the volume of croaks at the pond, the compound spot varies in intensity over time as molecules blink on and off.”,”To create their new method, the team first modeled the entire path of light through the system—from the photons leaving the fluorophore to the creation of the spot detected by the microscope. From this, they produced a \”trace,\” or plot, of the spot’s intensity over time that depends on all the system parameters, both known and unknown.”,”Armed with this machine learning model, the researchers then turned to figuring out the unknown parameters in an actual image of a spot of light detected by a microscope. To do this, they fit their model to a trace of that spot’s intensity over time.”,”By tweaking the parameters of their model to reproduce the real trace, they were able to infer the unknown quantities, including the number of individual molecules contained in the single spot.”,”Unlike previous counting methods, which yield a single number of individual molecules contained in a spot, the new method, blinx, gives a probability distribution of all possible answers. This enables researchers to see the confidence of the model’s predictions and decide if they need more data.”,”\”Sometimes the data just doesn’t support a single answer. There might be so much fluctuation that the information is just not there,\” says Janelia Group Leader Jan Funke. \”This model has the capability to tell you: I really don’t know.\””,”blinx can also count more individual molecules than similar methods, making it potentially useful for identifying individual proteins in a sample, according to the researchers. Proteins are made up of varying amounts of different amino acids, so being able to detect the exact numbers of a few key amino acids could help identify which proteins are present.”,”Funke says he hopes that not only will biologists start using blinx, but that other researchers will improve the new method. \”I think this is laying the groundwork for a new generation of these kinds of algorithms,\” he says.”,”The researchers say that the development of blinx required a research institute like Janelia.”,”\”It’s a super ambitious project: there’s a relatively low chance that the thing is going to work, and it takes a lot of multidisciplinary expertise,\” says Alex Hillsley, a former postdoc in the Funke and Stern labs who led the project.”,”\”You need someone that really knows the chemistry, you need someone that really knows super-resolution imaging, you need someone who really knows the modeling, and I can’t imagine that coalescing except at a place like Janelia.\””,”\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\tProvided by\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\tHoward Hughes Medical Institute\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t”,”\n\t\t\t\t\t\t\tMore from Optics\n\t\t\t\t\t\t “]’>Источник