Прецизионное редактирование генов имеет решающее значение для лечения генетических заболеваний, поскольку позволяет целенаправленно исправлять специфические мутации. Корейская исследовательская группа стала первой в мире, кто значительно повысил низкую эффективность ключевого механизма редактирования генома, известного как гомологичная рекомбинация (HR), путём индукции аутофагии — естественного процесса внутри клеток.
Исследование опубликовано в журнале Nucleic Acids Research.
Команда доктора Хе Джин Нам из Корейского научно-исследовательского института химических технологий (KRICT) в сотрудничестве с профессорами Дон Хён Джо и Сангсу Бэ из Сеульского национального университета медицины обнаружила, что индукция аутофагии посредством ограничения питательных веществ или ингибирования mTOR заметно повышает эффективность редактирования генов на основе HR с помощью CRISPR–Cas9 до трёх раз.
Техника была успешно валидирована в клетках, полученных от пациентов, несущих генетические мутации, и на живых моделях животных, что стало важным шагом к применению этого метода в терапевтических целях.
Технология CRISPR–Cas9 работает путём создания двунитевых разрывов (DSB) в ДНК для редактирования генов. Однако большинство этих разрывов восстанавливаются с помощью механизма, называемого негомологичным соединением концов (NHEJ), который часто приводит к непреднамеренным мутациям.
В отличие от этого, гомологичная рекомбинация (HR) — более точная форма репарации ДНК, но она происходит редко, что затрудняет прецизионное редактирование. Предыдущие попытки повысить активность HR, такие как модуляция клеточного цикла или ингибирование NHEJ, ограничивались токсичностью и плохой совместимостью в различных системах.
Подозревая, что аутофагия может способствовать использованию HR вместо механизмов репарации с ошибками, исследовательская группа изучила её влияние на редактирование генов.
Когда аутофагия была активирована — либо путём ограничения питательных веществ, либо путём лечения ингибиторами mTOR — эффективность редактирования на основе HR увеличилась в 1,4–3,1 раза для различных генов-мишеней и размеров вставок ДНК. В отличие от этого, клетки, неспособные подвергаться аутофагии, не показали такого улучшения, что подчёркивает важную роль аутофагии в стимулировании точного восстановления генома.
Даже альтернативные версии CRISPR, такие как никаза Cas9 (nCas9) и мёртвая Cas9 (dCas9), показали улучшенную эффективность редактирования в условиях аутофагии. Это говорит о том, что стратегия широко применима на разных платформах редактирования генов. Дальнейший анализ показал, что аутофагия усиливает накопление белков, связанных с HR, в комплексе Cas9, что может помочь направить активность репарации на более точные результаты.
В экспериментах с использованием клеток, полученных от пациентов, несущих мутации в гене MPZL2, связанном с потерей слуха, метод привёл к увеличению экспрессии исправленного гена до трёх раз.
Исследовательская группа также протестировала подход на мышиных моделях. Когда редактирование генов было выполнено в сетчатке мыши, индукция аутофагии привела к примерно трёхкратному улучшению эффективности редактирования. Это подтверждает, что стратегия работает не только в культивируемых клетках, но и в живых организмах.
Это исследование впервые демонстрирует, что аутофагия может повысить точность редактирования генома как в клетках человека, так и в животных моделях. Результаты указывают на новый путь в генной терапии, предлагая более безопасный и эффективный способ точной коррекции дефектных генетических последовательностей.
Доктор Нам заявила: «Использование аутофагии для усиления гомологичной рекомбинации представляет собой прорыв в стратегии преодоления ключевых ограничений в современных технологиях редактирования генов».
Президент KRICT Ён-Кук Ли добавил: «Это достижение значительно повышает эффективность и безопасность редактирования генома и знаменует собой важную веху в развитии прецизионной терапии».
Предоставлено Национальным советом по научным и технологическим исследованиям.