Недавно в новостях сообщалось о случае в Пенсильвании, где ребёнку с редким генетическим заболеванием было проведено персонализированное лечение, которое исправило его специфическую генетическую мутацию. Лечение было создано с использованием метода редактирования генов, называемого базовым редактированием, — метода, разработанного Алексис Комор, когда она была докторантом в группе молекулярного биолога Дэвида Лю в Гарвардском университете.
С момента публикации этой работы в 2016 году Комор, которая сейчас является доцентом кафедры химии и биохимии в Калифорнийском университете в Сан-Диего, продолжает изучать инструменты базового редактирования, чтобы лучше понять и развить их возможности. Её последнее исследование, опубликованное в Nature Communications, описывает, как можно манипулировать определёнными белками, участвующими в репарации ДНК, для достижения желаемых результатов.
Основы геномной ДНК
Наша геномная ДНК состоит из четырёх оснований: цитозина (C), тимина (T), гуанина (G) и аденозина (A). Эти основания соединяются, образуя примерно 3 миллиарда различных пар оснований, расположенных в структуре двойной спирали.
Люди на 99,9% идентичны по своему генетическому составу, а оставшиеся 0,1% объясняют любые различия между людьми. Там, где у одного человека есть основание C, у другого может быть основание T. Между любыми двумя людьми возможны миллионы генетических вариаций, и хотя многие из них безвредны, другие могут привести к изнурительным или смертельным генетическим заболеваниям.
Для многих людей с генетическими заболеваниями редактирование генов — это единственная надежда на излечение.
Традиционное редактирование генов
Традиционно редактирование генов осуществляется с помощью CRISPR-Cas9 для внесения физических изменений в ДНК. Направляющая РНК направляет белок Cas9 к определённому участку ДНК, где Cas9 полностью разрывает ДНК — это называется двунитевым разрывом. В клетке есть множество белков, которые могут обнаруживать повреждение ДНК и затем восстанавливать его через процесс, называемый путём репарации.
Обычно эти пути берут два разорванных конца ДНК и соединяют их обратно вместе, что называется лигированием. С помощью CRISPR-Cas9 по мере увеличения количества разрывов и ремонтов растёт и количество нежелательных вставок и делеций, называемых инделами. Когда это происходит, цепь ДНК больше не соответствует исходной, и процесс редактирования заканчивается.
Базовое редактирование
В качестве постдокторанта Комор нашла способ добиться более эффективного редактирования генов и снизить частоту инделов, избегая двунитевых разрывов. Она назвала этот новый класс инструментов «базовым редактированием», потому что он химически изменяет основание ДНК по одному.
«С помощью базового редактирования мы не только достигаем лучшего результата, но и улучшаем шаги, ведущие к результату», — заявила Комор. «Двунитевые разрывы могут быть токсичными и вызывать гибель клеток. Они также могут вызывать крупномасштабные геномные перестройки, потому что вы физически разрезаете ДНК. Базовые редакторы избегают этого».
Комор разработала два инструмента: аденозиновый базовый редактор (ABE), который преобразует основание A в основание G, и цитозиновый базовый редактор (CBE), который преобразует основание C в основание T. Базовые редакторы осуществляют преобразования через посредника. В случае CBE цитозин сначала преобразуется в урацил, нуклеиновую кислоту, обнаруженную в РНК. Во время репарации ДНК считывает урацил как тимин.
Хотя двунитевого разрыва нет, базовые редакторы создают nick (однонитевой разрыв) в одной цепи. К Cas9 прикреплён фермент, который химически изменяет основание. CBE могут иметь коэффициент конверсии 90–95% с минимальным количеством нежелательных побочных продуктов.
Комор и её группа хотели ответить на главный вопрос: как работает базовый редактор? Они задавались вопросом, как клетка обрабатывает урацил. Какую роль играет nick? Как все различные белки в клетке влияют на результаты редактирования?
Исследование белков, участвующих в репарации ДНК
Один конкретный белок, называемый урацил-N-гликозилазой (UNG), находит и удаляет урацилы. Когда этот белок присутствует, частота нежелательных исходов возрастает. Когда UNG ингибируется, эффективность CBE увеличивается. Но группа Комор не имела полного понимания процесса.
Чтобы найти ответ, команда использовала технику, называемую нокдауном гена, которая снижает способность гена экспрессироваться. Они сделали это для каждого отдельного белка, участвующего в репарации или обработке ДНК, в геноме человека — всего 2 015 белков.
Затем они использовали зелёные флуоресцентные белковые маркеры для идентификации клеток, содержащих желаемые изменения, либо мутации C в T, либо затронутые UNG мутации C в G, отбрасывая нежелательные мутации, затронутые UNG.
Они проделали эту работу, используя экран CRISPRi, который направляет направляющую РНК к интересующему гену и снижает его экспрессию. Клетки Комор CRISPRi имели две направляющие РНК — одну для активации флуоресцентного белкового маркера с CBE и одну для подавления специфического белка репарации. Всего у Комор была библиотека из примерно 12 000 различных комбинаций направляющих РНК для экрана CRISPRi.
После того как они собрали все клетки, которые флуоресцировали зелёным, они секвенировали направляющие РНК, чтобы увидеть, какие гены были подавлены (и, следовательно, их экспрессия была вредна для базового редактирования).
Они обнаружили, что лигаза, называемая Lig3, ингибирует базовое редактирование. Лигазы присоединяют концы разорванных цепей ДНК обратно вместе, и когда присутствует Lig3, редактирование CBE снижается.
«Мы думаем, что Lig3 может прокрасться и снова соединить этот nick. Тогда у нас больше не будет шанса превратить этот урацил в тимин», — заявила Комор. «Это похоже на то, что Lig3 работает против нас».
Они также обнаружили путь репарации, называемый репарацией несоответствия, который фактически помогал редактированию цитозинового основания. Комплекс белков MutS-alpha, компонент репарации несоответствия, состоит из двух белков и экспрессируется на протяжении всей жизни клетки. Когда он был подавлен, конверсии C в T снизились. Комор считает, что это связано с тем, что MutS-alpha распознаёт урацил-посредник и помогает преобразовать его в тимин.
Важность понимания механизмов базового редактирования
«Эти инструменты базового редактирования хороши, но они не идеальны», — заявила Комор. «Если мы сможем лучше понять, как они функционируют в клетке, это поможет нам понять, как мы можем повысить их эффективность или даже создать новые типы базовых редакторов».
Комор также отмечает, что важно понимать, как работают эти инструменты, по соображениям безопасности. Активирует ли базовое редактирование непредвиденный клеточный ответ? Есть ли повреждение ДНК или гибель клеток? Чем больше мы знаем о механизмах работы базовых редакторов и о том, как клетки реагируют, тем лучше мы сможем наблюдать и предотвращать непредвиденные последствия.
«Это одна из причин, по которой эта работа была поддержана Национальным научным фондом. Это фундаментальная наука — понимание того, почему вещи устроены так, как есть, и как они функционируют в определённых средах», — сказала Комор.
Часто для того, чтобы увидеть реальное влияние фундаментальных научных исследований на жизнь людей, требуются десятилетия, но методы базового редактирования Комор были внедрены в больницах гораздо быстрее. Она отмечает, что на сегодняшний день по меньшей мере 10 человек были спасены с помощью CBE. Кроме того, в настоящее время проводится несколько клинических испытаний, а это значит, что это число, скорее всего, значительно увеличится в ближайшие годы.