Оксидоредуктазы — ключевые ферменты в биокатализе, но их зависимость от кофактора никотинамидадениндинуклеотида (фосфата) (NAD(P)) создаёт проблемы из-за высокого потребления и связанных с этим затрат. Повышение эффективности использования кофактора у этих ферментов в биокатализе имеет большое значение.
Фермент слияния — это широко используемая стратегия регенерации кофактора, но высокое потребление и ограниченное восстановление кофактора ограничивают устойчивость каталитического процесса. Поэтому существует острая необходимость в разработке методов снижения использования NAD(P) для повышения эффективности процессов, катализируемых оксидоредуктазами.
Группа исследователей под руководством профессора Янь Сунь (Тяньцзиньский университет) разработала пептидно-сшитую фузионную оксидоредуктазу с электростатической передачей кофактора, сократив потребление NADPH на два порядка или сократив время реакции втрое при том же вводе кофактора.
Результаты были опубликованы в Chinese Journal of Catalysis.
Для соединения монооксигеназы фенилацетона и фосфитдегидрогеназы была разработана стратегия пептидного мостика, чтобы создать канал для передачи никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADP) через мост с помощью моделирования молекулярной динамики (MD) и экспериментальных проверок.
Декапептидный линкер R10 (RRRQRRRARR) был идентифицирован как наиболее эффективный. R10, связывающий фермент слияния (FuE-R10), демонстрирует более высокие конверсии, чем смешанная система свободных ферментов (MFEc) и гибкий пептидно-связанный фермент слияния FuE-GS10 при низком соотношении NADPH/фермент (0,1).
Более того, FuE-R10 продемонстрировал значительно увеличенные коэффициенты эффективности транспортировки по сравнению с другими FuE, что указывает на ограниченное диффузию NADP и эффективную транспортировку между связывающими карманами NADP у ферментов.
Моделирование MD показало положительное значение энергии диссоциации для NADP в FuE-R10, что доказывает установление канала для кофактора через пептид. Эксперимент по конкурентной побочной реакции показал эффективность FuE-R10 в подавлении побочной окислительной реакции на NADPH, дополнительно подтверждая наличие передачи кофактора в FuE-R10.
Электростатическая передача кофактора была дополнительно подтверждена путём исследования влияния ионной силы на каскадные реакции. Более того, сокращение пептидного моста до пяти остатков аргинина (FuE-R5) дополнительно усилило эффект передачи, что продемонстрировано увеличением подавления побочной окислительной реакции и увеличением каскадной конверсии по сравнению с FuE-R10.
Примечательно, что при 1 мкмоль/л NADPH и 5 мкмоль/л FuE-R5 функционировал как 5 мкмоль/л MFEc при 150 мкмоль/л NADPH в синтезе сложных эфиров. Это означает, что ввод кофактора может быть уменьшен на два порядка (до 1/150) при использовании FuE-R5 вместо MFEc, и фермент слияния может эффективно работать при субстехиометрической концентрации NADP по отношению к ферменту слияния.
Таким образом, это исследование открыло новый путь к разработке каскадного биокатализа с передачей кофактора для эффективного и устойчивого использования кофакторов.
Предоставлено Китайской академией наук.