Исследователи из Гарвардского университета в рамках проекта Broad Institute сообщают, что расширение секвенирования генома in situ (ExIGS) позволило связать ядерные аномалии с очагами аберрантной регуляции хроматина, что потенциально приводит к разрушению клеточной идентичности. Полученные данные проливают свет на механизмы, связанные с возрастными нарушениями работы клеток, и демонстрируют способность ExIGS одновременно секвенировать ДНК и визуализировать белки на наноуровне.
Микроскопия и секвенирование: интеграция методов
Под микроскопом клетки можно идентифицировать по размеру, форме, структуре и виду органелл. Ядерная морфология оказалась особенно важной в патологии, поскольку аномалии в форме ядра или структуре хроматина являются признаками механических сбоев, часто помогающими в диагностике рака и заболеваний крови.
Геномное секвенирование сместило акцент на эпигеномные, транскриптомные и протеомные измерения для определения типов клеток и их состояний, позволяя исследователям заглянуть в потенциальные причины морфологии заболеваний.
Микроскопия позволяет наблюдать результаты сбоя механизма, но даёт мало информации о причинах. Секвенирование может выявить геномные основы изменений, но не учитывает тканеспецифический контекст внутри клеточной среды.
Недавние методы пространственной геномики, такие как ExIGS, начали объединять микроскопию и секвенирование для картирования транскриптомов в тканях с разрешением отдельных клеток.
Исследование
В исследовании «Расширение секвенирования генома in situ связывает ядерные аномалии с аберрантной регуляцией хроматина», опубликованном в Science, исследователи разработали ExIGS для секвенирования геномной ДНК и локализации ядерных белков с наномасштабным разрешением внутри отдельных клеток.
С помощью ExIGS было проанализировано 63 здоровых фибробласта кожи для измерения прироста прочтений после расширения и 109 лёгочных фибробластов из широко используемой клеточной линии. Все образцы были исследованы на наличие маркеров ядерной оболочки и хроматина.
Фибробласты от пациента с прогерией предоставили 196 ядер наряду с 63 ядрами от здоровых контрольных образцов. Образцы прогерии были выбраны, поскольку прогерия вызывает быстрое старение ядра через дефектный белок ламина, и нарушения в этих клетках хорошо изучены в патологии.
Ткани сердца мыши и фибробласты от 92-летнего донора расширили сравнение старения.
Этапы исследования
В фазе 1 образцы прошли двухэтапный процесс закрепления для сохранения сигналов геномной ДНК и белков в расширяемой полимерной матрице. В фазе 2 амплификация по методу катящегося кольца позволила получить клональные наношарики в геле. Наношарики ампликона извлекаются и секвенируются на стандартной платформе Illumina. В фазе 3 мультимодальные данные интегрировались с помощью вычислительного конвейера, чтобы определить, какая ДНК была обнаружена в каком месте внутри расширенной клетки.
Используя ExIGS с расширенными образцами, было получено более чем в 10 раз больше прочтений ДНК на ядро, при этом трёхмерная структура оставалась неповреждённой. Примерно 33,6% прочтений были сопоставлены в пределах 200 нм от ядерных белков.
Регионы ДНК вблизи ядерной оболочки (ламина) имели тенденцию быть неактивными, тогда как регионы вблизи ядерных пятнышек имели тенденцию быть активными.
В клетках пациентов с прогерией ядерная оболочка утолщалась и складывалась внутрь, создавая небольшие области, где активная ДНК была вынуждена приблизиться к оболочке и выглядела репрессированной.
Авторы приходят к выводу, что организация ламина действует как ключевой регулятор активности генов, а аномальные складки ламина создают очаги молчащей ДНК, которые могут приводить к дисфункции клеток при старении и заболеваниях.
ExIGS предлагает мощный новый способ картирования того, как ядерная структура влияет на функцию генома, что позволяет изучать такие заболевания, как прогерия, сердечно-сосудистые заболевания и нормальное старение.