Учёные из Института эволюционной антропологии Макса Планка решили давнюю проблему редактирования генома с помощью CRISPR — точного прогнозирования активности направляющей РНК (gRNA).
В отличие от предыдущих инструментов прогнозирования, которые обучались на транскрибированных gRNA и поэтому были склонны к транскрипционным смещениям, новый подход фокусируется на химически синтезированных gRNA. Они широко используются в исследованиях и, вероятно, станут предпочтительным форматом для клинических приложений.
В исследовании, опубликованном в журнале Nature Communications, учёные разработали простую линейную модель под названием EVA score, которая может надёжно предсказывать активность gRNA в различных типах клеток и наборах данных.
«Химический синтез позволяет избежать некоторых связанных с последовательностью ошибок транскрибированных gRNA», — говорит Стефан Ризенберг, руководивший исследованием. «Эта разница в сочетании с более точной количественной оценкой результатов клеточного расщепления CRISPR позволила нам построить простую модель прогнозирования, которая обобщается для разных типов клеток».
Авторы предварительно рассчитали оценки EVA для всех gRNA в геномах человека и мыши. Эти данные можно легко получить через треки браузера генома.
Помимо прогнозирования активности gRNA, исследование предлагает новую модель эффективности репарации с направляющей по гомологии (HDR) — полезное достижение для точных задач редактирования генома, таких как исправление точечных мутаций. Авторы определяют особенности последовательности, которые значительно влияют на успех HDR, такие как неправильное сворачивание донора и тип изменения нуклеотида, что позволяет добиться эффективности HDR до 78% в оптимальных условиях.
Безопасность — ключевой фактор для терапевтического применения
Помимо эффективности редактирования, исследование также затрагивает вопросы безопасности, критически важные для терапевтического применения. Изучая результаты редактирования CRISPR-Cas9 и Cas12a, исследователи обнаружили высокую распространённость скрытых ремонтных событий — геномных изменений, не выявляемых стандартными ПЦР-анализами, включая большие делеции и идеально восстановленные разрывы, неотличимые от немодифицированной ДНК.
Важно, что исследование показывает: Cas12a склонен предпочитать идеальное восстановление крупномасштабным повреждениям, что делает его потенциально более безопасным, чем Cas9, для терапевтического использования. Структурные различия в расщеплении ДНК — Cas12a создаёт ступенчатые разрезы со «липкими» концами — могут объяснить расхождение в результатах репарации.
Полученные результаты имеют важное значение для исследований и терапии на основе CRISPR, предлагая инструменты для разработки более эффективных и безопасных стратегий редактирования генома.